筆記: 測試前取兩個或三個不同的樣本進行預測.
操作設備: 分光光度計
目錄號: BC1190
尺寸: 50T/24S
成分:
| 試劑 | 數量 | 貯存 | 準備 |
|---|---|---|---|
| 萃取液 | 30 毫升× 1 | 4℃ | – |
| 試劑一 | 粉末× 2 | 4℃ | 添加 3.3 使用時溶解的稀釋劑毫升數. |
| 試劑二 | 10 微升× 1 | 4℃ | 稀釋用 2 µL 試劑 II 和 10 使用前毫升蒸餾水. |
| 試劑三 | 60 毫升× 1 | 4℃ | 將結晶底部放入50°C水浴中溶解. 如果底部仍結晶，則使用上清液. |
| 試劑四 | 30 毫升× 1 | 4℃ | – |
| 試劑V | 10 毫升× 1 | 4℃ | – |
| 標準 | 粉末× 1 | 4℃ | 添加 0.405 mL 蒸餾水至 10 毫克還原型穀胱甘肽 (還原型穀胱甘肽) 使用時. |
| 沖淡 | 20 毫升× 1 | 4℃ | – |
產品描述:
- 穀胱甘肽過氧化物酶 (GPX), 也稱為 GSH-Px 或 GPX, 是體內廣泛存在的一種重要的過氧化物酶.
- GPX 在催化還原型穀胱甘肽轉化中發揮重要作用 (還原型穀胱甘肽) 氧化型穀胱甘肽 (GSSG) 以及將有毒的過氧化氫還原成無毒的羥基化合物.
- GPX 的酵素作用涉及過氧化氫對 GSH 的氧化, 從而產生 GSSG.
- GSH 與 DTNB 反應形成具有特徵吸收峰的化合物 412 奈米.
- 吸光度下降 412 nm 作為 GPX 活性的指標.
需要但未提供的試劑和設備:
分光光度計, 平衡, 桌上型離心機, 1 毫升玻璃比色皿, 研缽/均質器, EP管.
程式
我. 樣品製備:
組織:
符合率 組織重量 (G): 萃取液 (毫升)=1:5〜10 (建議 0.05g 組織與 1mL 萃取液), 冰浴勻漿. 離心機在 5000 4℃時每分鐘轉數 10 分分鐘, 取上清液, 並將其置於冰上進行測試 (如果上清液不清澈, 離心機用於 3 分分鐘).
細菌或細胞
細胞數量 (104): 萃取液 (毫升): 500〜1000:1 (加入1mL萃取液至 5 百萬個細胞), 超音波+冰浴破碎細胞(300瓦,3s, 間隔7秒,總時間 3 分分鐘). 離心於 5000 4℃時每分鐘轉數 10 分分鐘, 取上清液置於冰上待測 (如果上清液不清澈, 離心機用於 3 分分鐘).
血清樣本: 直接檢測
二. 決心 程式:
- 預熱分光光度計 30 分分鐘, 調整波長至 412 奈米, 並用蒸餾水調零.
- 標準溶液為 20 μmol/mL 稀釋至 0.25 萃取液μmol/mL. 標準溶液為 100 μL 混合 400 µL 試劑 IV, 標準溶液的濃度為 0.05 微摩爾/毫升. 標準溶液是在使用溶液混合物時配製的.
- 混合 150 µL 樣品 150 μLof 試劑 I 並在室溫下放置 5 分分鐘.
- 手術台: (1.5 mL離心管中依序加入以下試劑).
| 試劑名稱(微升) | 試管 (時間) | 控制管 (C) |
| 樣品上清液 | 100 | – |
| 試劑一 | 100 | 100 |
| 預熱 5 37℃ 分鐘 | ||
| 試劑二 | 50 | 50 |
| 反應為 5 37℃ 分鐘 | ||
| 試劑三 | 1000 | 1000 |
| 樣品混合物 | – | 100 |
離心機在 4000 室溫下轉速 5 分鐘，取上清液至 EP 管中.
| 試劑名稱(微升) | 試管 (時間) | 控制管 (C) | 標準管 (S) | 黑管 (乙) |
| 沖淡 | – | – | – | 500 |
| 上清液 | 500 | 500 | – | – |
| 標準混合物 | – | – | 500 | – |
| 試劑四 | 500 | 500 | 500 | 500 |
| 試劑V | 125 | 125 | 125 | 125 |
攪拌均勻. 然後置於室溫下 15 分分鐘, 處的吸光度 412 奈米測量. 吸光度記錄為 AT, 交流電, 作為, 和AB, 分別. 計算 ΔAT = AC – 在, ΔAS=AS – AB.
三、. 計算:
抑制百分比的計算 抑制百分比=(一隻貓)/(交流-AB)×100%
越遠越好, 樣品的抑制百分比在範圍內 30-70%, 並且越接近 50%, 越準確. 如果抑制百分比小於 30% 或超過 70%, 通常需要調整劑量並重新確定. 如果抑制率高, 樣品應適當稀釋. 如果抑制率低, 高濃度樣品需重新製備.
GPX活性的計算
- 蛋白質濃度:
單位定義: 1個酵素活力單位定義為反應體系中每分鐘催化氧化1nmol GSH的酵素量, 每毫克蛋白質.
GPX (U/毫克蛋白質) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(心肺復甦×VSV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷Cpr
- 樣品重量
單位定義: 1個酵素活力單位定義為催化氧化反應的酵素量 1 反應體系中每分鐘nmol GSH, 每克樣品.
GPX (單位/克重量) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(VSV÷VTV×W)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷W
- 細胞數量
單位定義: 1個酵素活力單位定義為反應體系中每分鐘催化氧化1nmol GSH的酵素量, 每一個 104 細胞.
GPX(U/104細胞) =ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷(N×VSV÷VTV)÷T=200×ΔAT÷ΔAS÷N
- 液體量:
單位定義: 1個酵素活力單位定義為催化氧化反應的酵素量 1 反應體系中每分鐘nmol GSH, 每毫升液體.
GPX (單位/毫升)=ΔAT÷(ΔAS÷CS)×1000×VEV÷VS÷T=200×ΔAT÷ΔAS.
CS: 標準混合物的濃度, 0.08 微摩爾/毫升;
車輛車輛: 酵素反應體系體積, 1.25毫升;
電壓: 樣品混合物中所含的樣品體積, 0.1 毫升; 越南電視台: 萃取液體積, 1 毫升;
心肺復甦: 上清液蛋白濃度, 毫克/毫升;
時間: 反應時間, 5 分分鐘;
氮: 細胞數量, 成千上萬; 瓦: 樣品重量, G;
1000: 1 微摩爾=1000納摩爾.
筆記:
- 當吸光度大於 1.2, 建議樣本經萃取稀釋後測定
- 建議不要一次取樣太多, 避免測試時間過長對顯色的影響, 這可能會讓決心不
實驗實例：
- 取小鼠肝臟0.1g, 加入1mL萃取液, 勻漿, 並研磨. 取上清液, 將其稀釋為 40 次, 根據測量值進行測試計算AT=0.108, 交流=0.303, AS=0.491AB=0.033,ΔAT=AC-AT=0.195 ΔAS=AS-AB=0.458, 根據樣品重量計算酵素活力:
GPX (單位/克重量)=200×ΔAT÷ΔAS÷W×40（稀釋倍率）=34061 U/g.
- 取楊葉1克, 加入1mL萃取液, 勻漿, 並研磨. 計算AT=0.220, 交流=0.318, AS=0.491, AB=0.033, ΔAT=AC-AT=0.098,ΔAS=AB-AB=0.458, 根據樣品重量計算酵素活力:
GPX (單位/克重量)=200×ΔAT÷ΔAS÷W=428 U/g.
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