什麼是DNA梯子? DNA梯子在PCR中扮演什麼作用?

聚合酶鍊式反應 (聚合酶鍊式反應) 徹底改變了分子生物學研究和診斷. 這種多功能技術可以在短短幾個小時內實現目標 DNA 序列的指數擴增. 但你怎麼知道你的 PCR 是否有效? 如果你產生了預期的產品, 如何確定其精確尺寸? 這就是DNA梯子發揮作用的地方.

什麼是 DNA 天梯?

DNA 梯子包含已知的 DNA 片段, 具體尺寸. 就像一把標有英吋或公分標記的尺子, 進行凝膠電泳時，DNA 梯子可作為尺寸參考. 透過將 PCR 樣本條帶與梯狀片段進行比較, 您可以估算未知 DNA 片段的大小.

DNA 梯子由 DNA 分子組成，範圍為 100 鹼基對超過 10,000 鹼基對. 片段通常是多個 100 或者 1,000 鹼基對. 梯子間隔為 100 bp 最適合用來測定小型 PCR 產物的大小, 儘管 1 kb 梯子對於較大的擴增子效果更好.

DNA 天梯是如何製作的?

雖然可以購買現成的梯子, 您也可以在實驗室中建立 DNA 階梯. 以下是一些常見的製備方法:

• 限制性內切酶消化 質粒DNA– Plasmids are cut with enzymes like HindIII or EcoRI to liberate specific-sized fragments.
• PCR 擴增– Target sequences of varying lengths are amplified individually and then combined into a ladder.
• 多聯體的部分消化– Tandem repeats of a DNA sequence are cleaved to produce multimers.
• 合成寡核苷酸雜交– Short single-stranded DNA fragments are annealed into double-stranded multimers.

無論生產方式如何, 關鍵是產生一組覆蓋所需尺寸範圍的離散帶.

DNA Ladder 如何使用?

現在您已經了解 DNA 階梯是什麼了, 它是如何使用的? DNA 梯子有兩個基本目的:

1. 尺寸估計

透過在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠上運行 DNA 梯子和 PCR 樣本, 您可以估算未知 DNA 片段的大小.

電泳過程中, 梯子和樣品在凝膠基質中的遷移速度取決於其尺寸. 較小的碎片在凝膠中移動得更遠, 而較大的碎片滯後.

當 DNA 被染色並可視化時, 梯子碎片看起來很鋒利, 離散帶. 將樣品帶與尺寸相符的階梯帶對齊, 您可以確定 PCR 產物的大致長度.

2. 品質管制

包含 DNA 梯子還可作為 PCR 擴增效果的視覺控制. 當您觀察到不同的樣本條帶在相對於梯子的預期位置遷移時, 這可以快速確認您的 PCR 是否成功.

如果你沒有看到任何樂隊, 梯子顯示電泳本身已正確執行. 這表示您的 PCR 反應可能失敗，需要進行故障排除.

我應該使用多大尺寸的 DNA Ladder?

提供多種 DNA 分子量標準, 如何為您的實驗選擇合適的? 以下是需要考慮的關鍵因素:

• 尺寸範圍– The ladder range must encompass your expected PCR product sizes. 對於以下擴增子 1 知識庫, A 100 BP 或 1 kb梯子合適. 對於較大的產品, 選擇更高的梯子，例如 5 KB 或 10 知識庫.
• 帶間距– Ladders with more reference bands in a given size range allow greater sizing precision. 然而, 間隔緊密的條帶需要更長的時間才能完全解析. 如果時間有限或您只需要大概尺寸, 使用碎片較少的梯子.
• 準備載入– Premade, 隨時可裝載的梯子保證了準確的條帶強度. 避免自己稀釋或混合梯子.
• 樣品數量– For multiple samples, 選擇較大的梯道尺寸以進行並排比較.
• 預算 – Consider the cost if producing large volumes of gels. 有些梯子更經濟.

如何讀取 DNA 天梯?

電泳後凝膠可視化後, 如何閱讀梯子來確定 PCR 產物大小? 按著這些次序:

1. 辨識包含 DNA 梯片段的泳道. 這通常會載入在第一個和/或最後一個通道中.
2. 根據梯子製造商的參考圖記下鹼基對 DNA 帶的大小. 梯子採用顏色編碼，方便閱讀.
3. 將未知樣品條帶與階梯進行比較, 識別階梯通道中最近的帶. 你的樂團的大小近似於梯子碎片.
4. 為了更高的精度, 在兩個梯子片段之間插入帶大小. 例如, 如果你的樂團在 500 和 600 bp梯帶, 估計其大小為 550 BP.
5. 提高尺寸精度, 延長凝膠運行時間以最大限度地提高梯帶之間的分離. 加載少量的梯子也可以提高條帶分辨率.

常用 DNA Ladder 的一些例子有哪些?

New England Biolabs 等製造商提供多種類型的 DNA 分子量標準, 賽默飛世爾, 和英傑公司. 一些常用的選項包括:

• 100 bp DNA 梯 – Contains 12 片段來自 100 BP 至 1,500 BP. 非常適合以下條件下的 PCR 產品 1,000 BP.
• 1 kb DNA 梯– Composed of 13 樂團來自 250 BP 至 10,000 BP. 非常適合擴增子鋼彈 10 知識庫.
• 1 kb Plus DNA 梯– Expanded version of 1 具有附加高分子量和低分子量片段的 kb 梯.
• FastDigest DNA Ladder– Pre-digested ladder ready for direct loading onto gels. 更少的頻段可實現更快的運行時間.
• 高分子量 DNA Ladder – Contains larger DNA fragments up to 48,500 bp 用於測定高分子量基因組 DNA 的大小.

如何準備和加載 DNA Ladder?

充分利用 DNA 階梯的優勢, 正確的準備和裝載技術是關鍵:

• Check ladder integrity before use – Inspect for any band smearing or degradation.
• Mix gently – Avoid vigorous vortexing to prevent shearing DNA.
• Use manufacturer-recommended amounts – Underloading gives weak band intensity. 過載導致飽和.
• Load ladder in first and/or last lane – Provides a size reference on both sides of your samples.
• Include a lane with no ladder – Serves as a contamination control.

遵循這些最佳實踐將為您每次提供最佳的階梯性能.

如何創建我的 DNA 階梯?

雖然購買預製梯是最簡單的途徑, 您也可以使用 PCR 和限制性消化來製作 DNA 梯子. 這是該過程的概述:

1. 設計 PCR 引子來擴增不同長度的特定目標序列, 例如 500, 750, 1,000, 和 1,500 BP.
2. 使用每個引子對執行單獨的 PCR，產生指定大小的 DNA 片段.
3. 純化 PCR 產物並量化每個片段的 DNA 濃度.
4. 用相同的限制性酶消化片段以產生相容的黏性末端.
5. 以特定摩爾比混合片段以獲得所需的條帶強度.
6. 連接片段形成由限制性位點分隔的多聚體.
7. 使用通用引子進行擴增以產生多聯體.
8. 使用原始限制性內切酶部分消化多聯體以在內部位點進行切割.
9. 純化消化物並將其混合到最終的 DNA 梯子中.

為什麼 DNA Ladder 對 PCR 如此重要?

DNA 分子量標準對於聚合酶鍊式反應至關重要 (聚合酶鍊式反應) 申請有幾個關鍵原因:

準確性和重複性

DNA 梯子可實現 PCR 結果的準確大小和一致的重現性. 透過將您的條帶與分子量標準的分子量標準進行比較, 您可以精確地確定擴增子大小並確認目標擴增成功. 這使得結果可以在不同的用戶之間可靠地重現, 裝置, 和實驗室.

標準化

包含 DNA 梯子可標準化多個 PCR 樣本之間的比較. 無論您是分析一份樣本的不同條件還是篩選大量患者樣本, 階梯提供了評估結果的持續參考. 標準化對於研究和臨床診斷的一致性至關重要.

最佳化

梯子透過指示擴增是否如預期發生來促進 PCR 優化. 意外的條帶大小或弱強度揭示了次優條件. 該梯子有助於排除協議故障以獲得最佳引物, 騎乘條件, 和樣品純度.

靈敏度

具有廣泛的梯子範圍, 即使是微弱的 PCR 條帶也可以視覺化並確定大小. 這使得檢測低模板拷貝對於病毒量監測等應用至關重要. 梯子提供的靈敏度支持 PCR 在單分子檢測中的使用.

多路復用

用於使用多個引子組的多重 PCR, 梯子驗證每個目標頻段的身份. 這使得能夠在一次反應中有效擴增多個序列.

自動化

DNA 梯子可實現 PCR 凝膠的自動軟體分析. 電腦演算法依靠梯子來標準化凝膠之間的帶遷移差異. 這允許高通量, 快速分析大量樣品.

簡而言之, DNA 梯子讓 PCR 更準確, 再現性, 標準化, 最佳化, 靈敏度, 復用能力, 和自動化. 無論您是在完善新方案還是分析臨床樣本, 這個重要的工具將擴大您的成功並支持出色的研究成果.