什麼是 PCR 預混液? 定量PCR混合? 你怎麼做到的?

聚合酶鍊式反應 (聚合酶鍊式反應) 是分子生物學和診斷學的重要工具. At the heart of every PCR reaction is the master mix – a premade cocktail containing all the key ingredients for DNA amplification. 但這個關鍵的 PCR 成分到底是由什麼組成的呢？? 為您的實驗制定完美的預混液時應考慮哪些因素? 這份綜合指南以簡單的術語將其全部分解.

什麼是 PCR 預混液?

A PCR預混液 是預混的, 即用型溶液，含有除 DNA 模板和引子外的聚合酶鍊式反應的所有必需成分. 它通常包括:

• DNA聚合酶
• 脫氧核苷酸 (dNTP)
• 反應緩衝液
• 氯化鎂
• 穩定劑和增強劑

透過準備預混液, 您可以將相同的最佳化配方等分到多個反應管或板的孔中. 這樣可以節省時間, 減少錯誤, 與將每個組分單獨添加到每個反應中相比，提高了一致性.

預混液是 PCR 遊戲規則的改變者, 實現簡化的高通量實驗設置. 無論您是執行常規 PCR 還是分析數千個樣本, 預混簡化了工作流程.

PCR 預混液有哪些類型?

有許多預混液產品針對不同類型的 PCR 應用進行了最佳化:

• Standard PCR –用於常規 DNA 擴增. 含有非校對聚合酶.
• 高保真PCR– Uses proofreading polymerases for cloning, 定序, 或需要高精度的應用.
• Multiplex PCR – 包含平衡引物，可在一次反應中共同擴增多個標靶.
• 實時定量PCR – 包括螢光報告基因，如用於定量的探針或 DNA 染料.
• RT-PCR – 含有用於擴增 RNA 模板的逆轉錄酶.
• Hot start PCR – 使用抑制劑阻斷的熱活化聚合酶可透過減少虛假擴增產物來提高特異性.
• Fast cycling PCR – 支援快速熱循環方案以提高通量.

許多預混液也經過預先優化，可用於某些 PCR 儀器或檢測化學物質（例如 TaqMan 探針）. 因此，將專門的混合物與您特定的 PCR 方案相匹配, 目標, 和獲得最佳結果的平台.

用於實時實驗的 qPCR Master Mix

用於實時定量 PCR (定量PCR) 實驗, specialized qPCR master mixes contain fluorescently labeled probes or DNA binding dyes to enable the detection and quantification of PCR products as they accumulate in “real-time” during thermocycling.

一些常見的實時 qPCR 主混合物類型包括:

• SYBR Green – 與雙股 DNA 結合時發出螢光的嵌入染料.
• TaqMan probe – 螢光團猝滅劑探針在擴增過程中被切割.
• Molecular beacon – 帶有猝滅劑的螢光髮夾探針可減少背景.
• Hybridization probe – 用於訊號產生的基於 FRET 的相鄰探針.

使用針對您的特定 qPCR 檢測化學配製和優化的預混液可簡化反應設定並提供可靠的, 敏感結果.

如何製作 PCR 預混液?

雖然高品質的商業預混產品隨處可見, 您也可以製作自訂 PCR 預混液。以下是涉及的關鍵步驟:

1. 選擇 DNA 聚合酶

這是催化DNA擴增最重要的成分. 受歡迎的選擇包括 Taq, 普夫, Q5, 菲森, 程式碼, 時間. 考慮持續性, 準確性, 延伸率, 選擇酵素時與 PCR 緩衝液的兼容性.

2. 準備優化的 PCR 反應緩衝液

緩衝液提供理想的 pH 值, 鹽濃度, 和聚合酶活性的輔因子兼容性. 常見的組件有:

• Tris-HCl 酸鹼度 8.5 – Maintains neutral pH at extension temperatures
• 氯化鉀或 (氨)2SO4 – Monovalent cations for conductivity
• MgCl2 – Essential divalent cation cofactor for polymerase
• PCR enhancers – Betaine, 二甲基亞砜, 穩定劑，如 BSA

3. 添加平衡的脫氧核苷酸 (dNTP)

使用 dATP 的等摩爾混合物, dCTP, dGTP, dTTP. 標準濃度為 100-200 各μM 脫氧核糖核酸.

4. 包括必需的輔助因子

氯化鎂 (氯化鎂) 是聚合酶活性和特異性的關鍵輔助因子. 包括在 1-5 毫摩爾終濃度.

5. 添加穩定劑

非離子型洗滌劑, 數位地面電視, 海藻糖, ETC. 有助於在儲存期間保持聚合酶活性.

6. 調整成分濃度

為了方便, 將成分量加倍或四倍來製作濃縮的 2X 或 4X 主混合物.

7. 等分前徹底混合成分

劇烈渦旋或重複移液以確保預混均勻.

8. 製作一次性等份用於儲存

避免凍融循環. 為了獲得最佳效果, 使用前將冷凍和解凍的等份儲存於冰上.

第一次開發主混音時, 遵循聚合酶製造商建議的緩衝液配方和成分濃度作為起點.

透過迭代測試優化濃度以最大限度地提高效率, 特異性, 靈敏度, 以及您特定 PCR 方案的一致性, 樂器, 和應用.

如何使用 PCR 預混液

在反應中使用 PCR 主混合物再簡單不過了. 以下是快速逐步概述:

1. 解凍 – Let the refrigerated master mix thaw completely on ice.
2. 渦流 – Mix well by vortexing or pipetting up and down to ensure homogeneity before aliquoting.
3. 等分 – Dispense appropriate volume of master mix per reaction into PCR tubes or plate wells based on the reaction size.
4. 添加底漆 – Pipette forward and reverse primers into each reaction tube/well.
5. Add template – 將 DNA 樣本或其他模板加入每個反應中.
6. 儲值 – If needed, 加入額外的 PCR 級水以達到最終所需的反應體積.
7. 混合 – Gently vortex or pipette mix to combine all components in each reaction.
8. Centrifuge – 短暫旋轉管/板以收集底部的內容物.
9. 聚合酶鍊式反應 – Place reactions in a thermal cycler and start your PCR run!

使用預混音時, 始終最後加入 DNA 模板, 引子後, 避免反應間的交叉污染.

PCR 預混液如何為 DNA 擴增提供動力?

PCR 主混合物以即用型形式包含 DNA 擴增的基本成分. 使用預混液可簡化反應設定, 減少錯誤, 並提高一致性.

不同類型的最佳化預混液可用於標準 PCR, 定量PCR, 高保真PCR, 逆轉錄聚合酶連鎖反應, 和更多. 您也可以製作自己的客製化組合, 但商業產品提供廣泛的品質測試和便利.

了解 PCR 主混合物有助於確保滿足您所有擴增需求的成功結果. 借助分子生物學工具包中預混液的力量, DNA 實驗變得容易.